非洲猪瘟荧光定量PCR仪标准化操作流程
一、实验前准备
1.设备预热：
开启
非洲猪瘟荧光定量pcr仪，选择预运行程序进行系统预热，建议预热时间≥30分钟。检查各温控模块性能，确保温度波动≤±0.5℃（95℃测试点）。
2.样本处理：
核酸提取：采用商品化核酸提取试剂盒，按说明书操作获取DNA模板。提取后的核酸需在2小时内完成检测，-20℃保存不得超过7日。
试剂准备：配制反应体系（20μL体系）：
（1）2×荧光PCR反应液 10μL
（2）引物探针混合液 1μL
（3）酶混合物 0.5μL
（4）模板DNA 5μL（浓度50-100ng/μL）
（5）灭菌ddH₂O 3.5μL
配置好的反应体系于冰上保存备用，避免反复冻融。
二、实验操作规程
1.上机设置
选择ASFV专用检测程序：
（1）预变性：95℃ 30s
（2）循环扩增（40 cycles）：
①变性：95℃ 5s
②退火/延伸：60℃ 30s
③荧光采集：FAM通道（探针检测）
2.样本装载
将配置好的反应管装入加热模块，确认：
（1）管盖密封完好
（2）试管无气泡残留
（3）样本编号与软件对应
设置阴性对照（N/C）、阳性对照（P/C）和标准品，建议每板设置3个N/C。
3.仪器运行：启动PCR程序，实时监控扩增曲线。正常状态下，阴性对照应无S型扩增，阳性对照CT值应在18-25之间。
三、结果分析与报告
1.数据分析
CT值判定标准：
（1）CT≤30且呈现典型S型曲线为阳性
（2）CT＞35或无扩增曲线为阴性
（3）30＜CT≤35需重复验证
FAM通道Ct值≤阈值（可参照试剂盒要求）判定为ASFV核酸阳性。
2.报告生成
报告内容应包含：
（1）样本编号及来源；
（2）CT值及扩增曲线图；
（3）阳性/阴性判定结果；
（4）检测及复核人员签名；
（5）检测日期及实验室信息；
3.废弃处理：实验结束后，生物危害废弃物需按规程处理，反应管置于专用废料桶中。
四、非洲猪瘟荧光定量pcr仪注意事项
1.操作全程必须穿戴防护服和手套；
2.每批次实验需同时设立阴、阳性对照；
3.仪器表面每日使用75%乙醇消毒；
4.建议每月使用标准物质进行仪器校准；
5.当检测结果异常时，必须进行复检确认。
本操作流程严格遵循GB/T 40947-2021《非洲猪瘟诊断技术》国家标准，规范化的操作可有效预防交叉污染，确保检测结果的准确性和重复性。实验室需建立完整的质量控制体系，定期对操作人员进行专业培训，为非洲猪瘟防控工作提供科学依据。
